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附錄A 規(guī)范性附錄。陸生植物生長試驗A，1。受試物信息，受試物信息包括但不限于,水溶性。蒸汽壓,結(jié)構(gòu)式 有機溶劑中的溶解度 正辛醇、水的分配系數(shù).吸收行為、純度,在水和光中的穩(wěn)定性,生物降解試驗的結(jié)果。A 2。試驗簡介A 2，1,試驗?zāi)康?。用于評價在一次性施用后,土壤中固態(tài)和液態(tài)的化學(xué)物質(zhì)對植物幼苗和早期生長的潛在毒性效應(yīng)。A,2。2.試驗原理、本附錄用于評價在土壤中?；蚱渌线m的土壤基質(zhì),施用供試品后對出苗和較高植物早期生長的影響，種子種入供試品處理過土壤中 在對照組出苗率達(dá)到50。后的14d。21d內(nèi)進行評價,終點測量是可見的出苗率，苗干重，也可為鮮重，某些情況下為苗高,也要評價植物不同部位上可見的有害的影響、這些測量和觀察與未處理的對照進行比較 根據(jù)可能的暴露途徑。供試品混入土壤.或可能的人工土壤基質(zhì) 或噴灑在土壤表面，這些途徑要盡可能正確代表化學(xué)品潛在的暴露途徑,土壤混合時先進行大量散土的混合、然后再裝入盆中。將所選植物種子種入土壤中。表面施藥時 先將土壤裝入盆中、將種子種好。然后再噴藥.試驗體系,對照和處理土壤及種子,放在適合植物生長的環(huán)境中、本附錄可根據(jù)研究目的測定劑量。反應(yīng)曲線,或單劑量,比率作為限度試驗,如果單劑量.比率試驗超出一定的毒性水平.例如觀察到的效應(yīng)高于x、要進行范圍篩選試驗測定毒性高限和低限、再進行多劑量試驗產(chǎn)生劑量，反應(yīng)曲線 適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計分析方法分析獲得最敏感參數(shù)的作用濃度ECx?；蛴行┯寐蔈Rx.如 EC25、ER25 EC50.ER50。同樣無作用濃度。NOEC，和最低作用濃度、LOEC.也能計算出來。A 2,3.參比物。定期進行參考物質(zhì)試驗，以確認(rèn)隨著時間的推移試驗性能和特定植物的反應(yīng)和試驗條件沒有明顯改變，可選的方法還有，實驗室用以往的對照組生物量測定或生長測量來評價試驗系統(tǒng)的性能?？梢宰鳛閷嶒炇覂?nèi)部質(zhì)量控制。A。2,4，限度。本附錄不能給出由受試物蒸發(fā)所造成的可能傷害結(jié)果。也未測定由于直接接觸植物所產(chǎn)生的傷害，A 3,設(shè)備與材料，人工生長箱，溫室或植物生長箱、生長容器應(yīng)為塑料器皿或瓷盆缽，A，4、試驗操作A,4，1.準(zhǔn)備自然土 人工基質(zhì)?？捎煤? 5，以上有機碳.有機質(zhì)約3。的沙壤土,壤質(zhì)沙土或沙質(zhì)黏壤土裝入花盆,種入植物。含1 5.以上有機碳的商業(yè)盆栽土或合成混合土均可用。如果供試品黏土有很高的親和力,則不可用黏土。耕地土應(yīng)過2mm篩使之均一，并去除粗糙顆粒。最終準(zhǔn)備土壤的類型和構(gòu)造、有機碳,pH，鹽含量和電導(dǎo)率應(yīng)報告.土壤應(yīng)巴氏消毒或熱處理消毒以減少土壤病菌的影響，由于物理.化學(xué)特征和微生物群落的改變,自然土可能使結(jié)果的解釋復(fù)雜化，增加變異性,這些變異依次為土壤持水能力,化學(xué)結(jié)合能力。通風(fēng)、營養(yǎng)和微量元素含量、除了物理因素的變異外，在化學(xué)特性上的變異。如pH和氧化還原電位，可以影響供試品的生物可用性 為盡可能減少自然土的變異性對試驗帶來的誤差 當(dāng)受試物不是植物保護產(chǎn)品時，可用人工基質(zhì)代替自然土進行試驗。所用基質(zhì)應(yīng)包含惰性物質(zhì)，減少與供試品、溶劑載體或兩者的相互反應(yīng).用酸洗過的石英砂、礦物絲和玻璃珠。如。直徑0,35mm.0，85mm、是合適的惰性物質(zhì)。可減少對供試品的吸收。保證供試品最大可能地經(jīng)根吸收達(dá)到幼苗，不適合的基質(zhì)包括蛭石。珍珠巖或其他高吸收性的材料、應(yīng)提供植物生長所需的營養(yǎng)、以保證植物沒有營養(yǎng)缺乏的壓力、可通過化學(xué)分析或?qū)φ罩参锏目梢娫u價進行評價 A,4，2,供試植物.選擇植物的種類應(yīng)考慮其在植物界中分類學(xué)上的多樣性。分布特征.種的特定生活史和自然界分布地區(qū)差異 具體包括下列特征，有均一的種子。從可靠的標(biāo)準(zhǔn)種子來源獲得、能產(chǎn)生持續(xù).可靠和一致的萌芽。以及一致的幼苗生長，植物應(yīng)適于在實驗室進行試驗。在實驗室內(nèi)及實驗室之間能夠得出可靠和可再現(xiàn)的結(jié)果、所用種的敏感性應(yīng)與環(huán)境暴露中的植物反應(yīng)一致,所選種已用以往的一些毒性試驗 它們在如除草劑生物測定 重金屬篩選，鹽度或礦物壓力試驗或植物相克研究中的使用表明對寬泛多樣性刺激存在敏感度.能夠適應(yīng)試驗方法中的生長條件。符合試驗有效性標(biāo)準(zhǔn)。試驗所用的種類數(shù)量根據(jù)相關(guān)的管理要求決定.附錄C中的植物測試試驗用物種供參考，A,4，3、供試品的施入,供試品應(yīng)添加到適當(dāng)?shù)妮d體上。如.水.丙酮.乙醇、聚乙二醇,阿拉伯樹膠、砂,也可用包含有效成分和各種助劑的制劑進行試驗,A、4.4,與土壤 人工基質(zhì)的混合、溶于水或可懸浮在水中的物質(zhì)可以直接配成水溶液 然后將水溶液與土在適當(dāng)?shù)娜萜髦谢旌?。此種類型試驗適合化學(xué)品通過土壤或土壤毛細(xì)水吸收 涉及根的吸收。供試品添加量不應(yīng)超過土壤持水力，每個濃度添加的溶液量應(yīng)一致,但要注意避免土壤結(jié)塊.水溶性低的物質(zhì)應(yīng)先溶入適當(dāng)?shù)膿]發(fā)性溶劑中。如。丙酮 乙醇，并與沙混合,用氣流將溶劑從沙中去除.處理的沙子與試驗土壤混合 設(shè)置只加沙子和溶劑的溶劑對照、各處理和溶劑對照應(yīng)加等量的混入溶劑并已去除溶劑的沙子、對于固體和不溶于水的供試品.直接和干土混合 此后 將土加入容器中 并立即種入種子,用人工基質(zhì)代替土壤時.在試驗開始前可直接將溶于水的化學(xué)品溶解到營養(yǎng)液中,不溶于水,但可以通過溶劑載體懸浮于水中的.可加入載體。再溶于營養(yǎng)液中，不溶于水.但沒有無毒的水溶性載體,可先溶于適當(dāng)?shù)膿]發(fā)性溶劑,溶液與沙子或玻璃珠混合。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，使化學(xué)品均勻地覆著在沙?；蛑樽由?、在分裝之前，取一部分稱重的玻璃珠用等量溶劑提取。進行化學(xué)分析，A.4、5 表面施用.對于作物保護產(chǎn)品.通常用土壤表面噴灑試驗溶液的方法進行施藥,進行試驗操作的所有設(shè)備。包括準(zhǔn)備和噴灑供試品的設(shè)備、都應(yīng)使試驗以精確的方式進行。能夠產(chǎn)生可重現(xiàn)性覆蓋.覆蓋應(yīng)均一分布在土壤表面.應(yīng)避免化學(xué)品被設(shè)備吸收或與設(shè)備反應(yīng)的可能 如，塑料管與親脂性化學(xué)品易反應(yīng)，或某些化學(xué)品對鋼材質(zhì)設(shè)備有腐蝕性。模仿典型的噴霧器將供試品噴灑在土壤表面.通常。噴灑量應(yīng)在正常農(nóng)用量的范圍內(nèi) 用量、水的量等。應(yīng)報告,選擇噴嘴類型以保證均一的土壤表面覆蓋量 如果應(yīng)用溶劑和載體、應(yīng)設(shè)置溶劑。載體對照、不必試驗作物保護產(chǎn)品的制劑 A。4。6.供試品濃度,比率的驗證。濃度應(yīng)經(jīng)適當(dāng)?shù)姆治龇椒炞C,對于可溶性物質(zhì).所有濃度的驗證可以通過分析用于逐級稀釋的最高濃度來確認(rèn)，用校準(zhǔn)設(shè)備,如、校準(zhǔn)分析用玻璃器具,校準(zhǔn)噴霧設(shè)備。進行逐級稀釋，對于不溶于水的物質(zhì),分析添加到土中的量，如果要證明供試品在土壤中的均一性，有必要進行土壤分析 A 4、7.試驗條件。試驗條件應(yīng)與試驗種和變種的正常生長條件相似、出苗的植物應(yīng)放在可控的氣候培養(yǎng)箱、人工氣候箱或溫室中進行園藝操作維持正常生長、采用生長設(shè)備時,應(yīng)保證植物正常生長、并與對照組對照、應(yīng)記錄包括條件控制和足夠頻率,如，每日.的溫度,相對濕度、二氧化碳濃度、光.照度 波長,光合有效輻射,光周期,平均灌溉量等參數(shù)。溫室溫度通過通風(fēng)，升溫和。或制冷系統(tǒng)來控制,下列條件通常為溫室試驗的推薦條件。溫度.22.10 相對濕度.70.25 光周期.最少16h光照,照度、24850，3550。lx.如果照度降到14200，lx以下.波長400nm 700nm 除某些種需減少照度外.需補充光照，試驗期間應(yīng)監(jiān)測和記錄環(huán)境條件.試驗所用容器應(yīng)為無孔塑料或玻璃容器 容器下面應(yīng)墊上托盤或碟子，容器應(yīng)定期重新擺放以減少植物的生長差異.因為生長設(shè)施的試驗條件不同。容器應(yīng)足夠大以保證正常生長，為維持好的植物活力、可以添加土壤營養(yǎng)液。通過觀察對照植物判斷添加營養(yǎng)液的需要和時機。推薦從試驗容器底部澆水。如、用玻璃纖維絲.對試驗植物種和供試品來說。特定的生長條件是適合的。參見附錄D。對照和試驗組植物應(yīng)放置在一樣的試驗環(huán)境條件下，然而,應(yīng)采取必要的措施防止不同處理間及對照與供試品間的交叉污染,如。揮發(fā)物質(zhì),A,4,8、試驗操作A.4，8。1.試驗設(shè)計,同樣種類的種子種植于容器中，每個容器中種入的種子數(shù)目應(yīng)根據(jù)植物種類.容器大小和試驗周期決定。試驗期間給植物提供充分的生長條件。避免過于擁擠、根據(jù)種子大小,最大的植株密度為3粒、100cm2,10粒、100cm2,例如。每個直徑為15cm的容器內(nèi)，可種1株 2株玉米，大豆.西紅柿，黃瓜或甜菜?？煞N3株油菜或豌豆?？煞N5株。10株洋蔥 小麥或其他小粒種子，種子數(shù)量和重復(fù)容器,一個重復(fù)指一個容器，容器內(nèi)的植物不是重復(fù) 應(yīng)足以采用理想的統(tǒng)計分析方法進行統(tǒng)計.每個重復(fù)用很少的大種子比每個重復(fù)用小種子時變異會較大，應(yīng)標(biāo)記?？梢酝ㄟ^每個容器內(nèi)同樣數(shù)量的種子降低變異.設(shè)置對照組保證觀察到的效應(yīng)與暴露的供試品有關(guān)或由供試品引起。除了不暴露于供試品外、適當(dāng)?shù)膶φ战M應(yīng)與試驗組在各方面都一樣。所有被試植物包括對照均應(yīng)來自同一來源,為避免偏離 對照和試驗組植物應(yīng)隨機分布、應(yīng)避免使用殺蟲劑或殺菌劑包被的種子、即、包衣,種子，特殊情況下允許使用某些非內(nèi)吸性接觸殺菌劑、如,克菌丹.福美雙。如果有種生病菌.可以把種子在5,次氯酸鹽中浸一下、然后在流水下漂洗再曬干 允許其他作物保護產(chǎn)品的非治療性處理。A、4，8，2，單濃度,比率試驗 進行單濃度試驗.限度試驗.時。未確定適當(dāng)供試品濃度,需要考慮很多因素，對一般化學(xué)品來說、應(yīng)考慮物質(zhì)的物理，化學(xué)特性 對作物保護產(chǎn)品而言。需要考慮物理、化學(xué)特性 供試品的使用模式 最大濃度或施用比率。每個生長季節(jié)施用次數(shù)和，或試用品的持久性。為測定一般化學(xué)品是否有植物毒素特性.通常以1000mg kg干土作為最大劑量，A 4，8,3，預(yù)試驗。進行正式的多濃度的劑量反應(yīng)研究前，需先進行預(yù)試驗確定劑量范圍。預(yù)試驗的濃度間距應(yīng)較寬,如、0。1mg.kg,1 0mg，kg,10mg,kg。100mg,kg和1000mg.kg干土.作物保護產(chǎn)品的濃度應(yīng)根據(jù)推薦或最大使用濃度或施用比率確定.如推薦、最大濃度或施用比率的1，100。1，10和1，1.A。4.8，4 多濃度,比率試驗.多濃度,比率試驗的目的是建立劑量反應(yīng)關(guān)系和測定萌芽率，生物量的ECx或ERx值和、或與未給藥的對照組比較的可觀察效應(yīng) 試驗濃度。比率的數(shù)量和間距應(yīng)足夠產(chǎn)生可信的劑量反應(yīng)關(guān)系和回歸線性方程并能得出估計的ECx或ERx值，所選濃度數(shù)量至少五個幾何級數(shù)并加上對照、相鄰的兩個濃度梯度不應(yīng)超過3個幾何級、每個處理和對照均至少有四個平行?？偟姆N子數(shù)應(yīng)至少20粒,對某些萌芽率低的植物或多樣化的生長特征的植物。增加平行數(shù)提高統(tǒng)計效力。A,4 8.5 觀察,在觀察期內(nèi)。即對照,溶劑對照,出苗率達(dá)到50。后的14d、21d內(nèi)。定期 至少1周 若可能每日,觀察植物是否出苗和可見的植物中毒死亡 在試驗結(jié)束時 記錄出苗率,存活植物的生物量和植物不同部位可見的毒害效應(yīng).后者包括已出幼苗形態(tài)上的異常。生長遲緩?？菸?變色，死亡和植物發(fā)育上的影響 最終生物量通過測定最終存活植株的平均苗干重完成,收割土壤表面以上的植株。在60。烘干至恒定的質(zhì)量,也可選擇以鮮重作為最終生物量、如有特殊要求、苗高可作為另一個重點指標(biāo)、可用一個統(tǒng)一的評分系統(tǒng)對可見的傷害進行評分來評價可觀察的毒性反應(yīng)。A、5。質(zhì)量控制 為保證試驗的有效性。對照應(yīng)符合下列形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，出苗率至少70,幼苗沒有可見的植物毒素影響。如，變色病,壞死病 枯萎 葉子和莖的畸形，個別種類的植株在生長和形態(tài)上只有正常變異。試驗期間。對照組幼苗平均存活率應(yīng)高于90、特定種類的環(huán)境條件應(yīng)一樣,生長介質(zhì)包含等量的人工土壤基質(zhì),支持介質(zhì)或同樣來源的物質(zhì)，A 6、數(shù)據(jù)和報告A、6、1 數(shù)據(jù)處理A、6.1,1，單濃度.比率試驗 每個植物種的數(shù)據(jù)都應(yīng)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法進行分析,報告試驗濃度，比率產(chǎn)生的效應(yīng)水平，或試驗濃度，比率下未見效應(yīng)，如在y濃度或比率觀察的效應(yīng).x.A 6 1，2、多濃度、比率試驗,根據(jù)回歸方程劑量,反應(yīng)關(guān)系?？捎貌煌哪Ｐ?如,出苗率等計數(shù)型數(shù)據(jù)ECx或ERx.如、EC25，ER25。EC50或ER50,和置信限的估算可用邏輯回歸法。概率法、韋博法,寇氏法進行統(tǒng)計.幼苗生長 質(zhì)量和高度。等連續(xù)型終點指標(biāo)ECx或ERx和可信限的估算可用適當(dāng)?shù)幕貧w分析,如.Bruce。Versteeg非線性回歸分析.如果可能、R2值為0.7或再高些,對多數(shù)敏感種來說.所設(shè)濃度.比率包含20,和80、效應(yīng)、如果要求NOEC。要求有更強大的分析性試驗,并且要在數(shù)據(jù)分布基礎(chǔ)上選擇。A,6,2 試驗報告.試驗報告應(yīng)包括試驗結(jié)果.試驗條件的詳細(xì)描述、結(jié)果的全面討論。數(shù)據(jù)的分析和結(jié)果分析.提供結(jié)果圖表和摘要.通常包括下列內(nèi)容.a,供試品、化學(xué)鑒定數(shù)據(jù),相關(guān)物質(zhì)特性,如可能.正辛醇。水的分配系數(shù)1gPow 水溶解度.蒸汽壓，環(huán)境歸宿和行為的信息、試驗溶液的制備細(xì)節(jié)和試驗濃度的驗證。b,試驗植物種。試驗生物的詳細(xì)資料,種.亞種,所屬植物科、學(xué)名和通用名 盡可能詳細(xì)的來源和歷史,即、提供者的名稱,萌芽率。種子尺寸級別,批號、產(chǎn)種年或選擇的生長季節(jié)。萌芽期等級、生存力等。所試驗的單子葉和雙子葉種的數(shù)量 選擇此種的理由，種子貯存.處理和維護的描述 c 試驗條件、試驗設(shè)施 如、生長箱 人工氣候箱和室溫 試驗系統(tǒng)的描述，如,容器直徑、容器材料和土壤量 土壤特性。土壤質(zhì)地或類型、土壤顆粒分布和分級，物理化學(xué)特征 包括有機物含量 有機碳含量和pH值 試驗前土壤、基質(zhì),如，土壤 人工土壤。沙子和其他.的制備、若用營養(yǎng)液.配方描述、供試品的施用、施用方法。設(shè)備 暴露承載量和體積 包括化學(xué)驗證 校準(zhǔn)方法,施藥期間環(huán)境條件的描述,生長條件、照度 光周期。最高，最低溫度。澆水時間表和方法，施肥、每個容器內(nèi)的種子數(shù)量,每個劑量植株數(shù)，每個暴露率的重復(fù)數(shù) 對照的類型和數(shù)量。陰性對照和、或陽性對照 溶劑對照，試驗周期.d、結(jié)果，每個重復(fù)、試驗濃度，比率和種子的所有終點數(shù)據(jù)表、與對照比較的萌芽數(shù)量和萌芽率,植株生物量、植株干重或鮮重.測定值與對照比率，若測量 植株高度與對照的比率，與對照比較的由供試品引發(fā)的可見的傷害率和可見的定性定量描述 黃化。壞死、枯萎.葉和莖的畸形和缺乏癥,如果提供可見傷害評分標(biāo)準(zhǔn)、判斷可見傷害描述 對于單劑量試驗,應(yīng)報告?zhèn)β?ECx或ERx.如、EC50.ER50、EC25，ER25，值和相關(guān)置信限，如果有回歸分析，提供回歸方程標(biāo)準(zhǔn)偏差，單個參數(shù)估計標(biāo)準(zhǔn)偏差。如 斜率、截距。若計算,NOEC，和LOEC.值,統(tǒng)計過程和假設(shè)檢驗的描述，數(shù)據(jù)表和試驗種的劑量。反應(yīng)關(guān)系圖,試驗過程中與方法的偏離和試驗中不可預(yù)見的情況的描述,